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蛋白共提取試劑盒對于體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法
發(fā)布日期：
2018-05-21
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蛋白共提取試劑盒是從培養(yǎng)細(xì)胞和動物組織樣品同時抽提RNA和DNAzui為快速簡單的方法。本試劑盒基于硅膠柱純化技術(shù)，提取過程中無需使用有毒的酚氯仿抽提，也無需進(jìn)行耗時的醇類沉淀，整個過程只需35分鐘。該方法得到的RNA可直接用于RT-PCR, Northern blot, poly-A 純化，核酸保護(hù)和體外翻譯等實驗。
1．根據(jù)用量取適當(dāng)?shù)臐{蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。PMSF需現(xiàn)用現(xiàn)加，若目標(biāo)蛋白含有豐富的半胱氨酸，可以在兩種蛋白抽提液中加入DTT至終濃度0.5mM。
2．對于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，或用EDTA消化后吹打下細(xì)胞（不用胰酶硝化，以免胰酶消化目的蛋白）。500g離心2～3分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清留下沉淀備用。
3．對于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，500g離心2～3分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
4．每20ul細(xì)胞沉淀加入200ul漿蛋白抽提試劑（2×106個細(xì)胞沉淀約20ul或40mg）。
5．用移液器吹打或高速渦旋15秒（可適當(dāng)延長），必須使細(xì)胞沉淀*分散開成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞沉淀分散不*會導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量降低。
6．冰浴10分鐘。
7．zui高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒，4℃12000～16000g離心10分鐘。
8．上清即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白，立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中備用，進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western等實驗，但蛋白濃度較低，可根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)濃縮。
9．沉淀即為細(xì)胞核，要*吸盡殘余的上清（避免細(xì)胞漿蛋白的污染），加入50-100ul核蛋白抽提試劑。
10．用移液器吹打或高速渦旋15秒（可適當(dāng)延長）至沉淀*分散，冰浴10分鐘。
11．zui高轉(zhuǎn)速劇烈渦旋10秒，4℃12000～16000g離心10分鐘。
12．立即吸取上清至預(yù)冷的樣品管中，此即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？蛇M(jìn)行后續(xù)實驗或-70℃凍存。
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